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產(chǎn)品說明：

使用說明：

建議工作濃度

1）大腸桿菌篩選：25-50μg/mL（低鹽LB培養(yǎng)基，NaCl濃度不能超過5g/L）

2）酵母菌篩選：50-300μg/mL（YPD或基本培養(yǎng)基）

3）哺乳動物細胞篩選：50-1000μg/mL（合適培養(yǎng)基，根據(jù)細胞系而不同）

操作步驟

一、建立殺滅曲線

1. 重新鋪板或者將滿盤細胞重新分盤，使得細胞密度約25%，按照8個平板/組準備，培養(yǎng)24 h。

2. 去除舊培養(yǎng)基。加入含不同濃度博來霉素的篩選用培養(yǎng)基，博來霉素濃度可設置為0，50，100，200，400，600，800和1000 μg/mL，每個濃度做3個平行；也可根據(jù)自身實驗體系，設置不同的濃度梯度。

3. 每3-4天更換新鮮的篩選培養(yǎng)基，并觀察存活細胞的比例。選擇在合適的時間（1-2周內(nèi)）殺死大多數(shù)細胞的濃度為最佳工作濃度。

【注】：若是難以在顯微觀察下區(qū)分活細胞，也可用臺盼藍染色來計算存活細胞的數(shù)量，以確定博來霉素的最適濃度。

二、篩選穩(wěn)定轉染細胞

1. 轉染細胞，用100 mm培養(yǎng)皿進行培養(yǎng)。以未轉染的細胞作為陰性對照。

2. 轉染后，用預熱的1× PBS洗滌一次，加入新鮮培養(yǎng)基。
3. 轉染48-72 h后，用含有最佳濃度博來霉素（由滅殺曲線確定）的新鮮培養(yǎng)基篩選細胞。為了更好的鑒定和篩選細胞集落，建議將細胞按比例稀釋成一系列濃度。
【注】：若待篩選細胞對博來霉素的抗性明顯強于大部分細胞，或者細胞快速分裂導致低濃度情況博來霉素的篩選效果不明顯，按照以下方法克服此類耐性：

a）將細胞直接用含博來霉素的篩選培養(yǎng)基進行分盤；

b）37℃孵育2-3 h直至細胞貼壁；

c）從培養(yǎng)箱內(nèi)取出細胞并于4℃放置2 h，一定要確保培養(yǎng)基內(nèi)含有HEPES。【此步的目的在于短時間內(nèi)終止細胞分裂活動，從而允許博來霉素抗性得以發(fā)揮，殺死細胞?！?/span>

d）細胞重新放回37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

4. 每3-4天加入選擇培養(yǎng)基，直到出現(xiàn)細胞集落。

5. 挑選并轉移克隆到96或48孔板中。在進行更大孔徑培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿上擴大培養(yǎng)之前，確保培養(yǎng)細胞密度近100%。

三、維持培養(yǎng)穩(wěn)定轉染細胞

可采取以下方式維持培養(yǎng)穩(wěn)定轉染細胞：

a）使用含相同劑量博來霉素的篩選培養(yǎng)基來維持培養(yǎng)；

b)  降低博來霉素劑量為原來的一半進行維持培養(yǎng)；

c）使用正好能預防敏感細胞生長但不足以致死的博來霉素劑量來維持培養(yǎng)【參考殺滅曲線】。

注意事項：

1）Zeocin?對光敏感，需將抗生素，或含該抗生素的平板或培養(yǎng)基置于黑暗處。

2）降低培養(yǎng)基的鹽濃度，調(diào)整pH到7.5使其保持活性，因高離子強度和酸或堿性都會抑制Zeocin?活性。

3）儲存Zeocin?在-30°C~-10°C，使用前需冰上融化。

4）Zeocin?有毒，操作時需注意防護，切勿與身體或皮膚直接接觸。

5）為了您的健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應用或其他用途。