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產(chǎn)品說明：

檢測原理

Cell Counting Kit-8簡稱CCK-8試劑盒，是一種基于WST-8（化學名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑單鈉鹽）的廣泛應用于細胞增殖和細胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。

WST-8屬于MTT的升級產(chǎn)品，工作原理為：在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（formazan）。顏色的深淺與細胞的增殖成正比，與細胞毒性成反比。使用酶標儀在450nm波長處測定OD值，間接反映活細胞數(shù)量。

CCK-8法應用非常廣泛，如藥物篩選、細胞增殖測定、細胞毒性測定、腫瘤藥敏試驗以及生物因子的活性檢測等。

CCK-8方法的優(yōu)勢

1） 表1 CCK-8法與其他細胞增殖/毒性檢測方法的優(yōu)勢比較

  2）酚紅和血清對CCK-8法的檢測不會造成干擾；

  3）細胞毒性非常低，因此加入WST-8顯色后，可以在不同時間反復用酶標儀讀數(shù)從而找到最佳測定時間。

CCK-8試劑盒操作說明：

一. 制作標準曲線（測定細胞具體數(shù)量）

1、先用細胞計數(shù)板計數(shù)所制備的細胞懸液中的細胞數(shù)量，然后接種細胞到培養(yǎng)板內(nèi)。

2、按比例（例如：1/2比例）依次用培養(yǎng)基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做3-5個細胞濃度梯度，每個濃度建議3-6個復孔。

3、接種后培養(yǎng)2-4小時使細胞貼壁，然后加CCK-8試劑培養(yǎng)一定時間后測定OD值，制作出一條以細胞數(shù)量為橫坐標（X軸），OD值為縱坐標（Y軸）的標準曲線。根據(jù)此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數(shù)量（使用此標準曲線的前提是實驗的條件要一致，便于確定細胞的接種數(shù)量以及加入CCK-8后的培養(yǎng)時間。）

二. 細胞活性檢測

1、在96孔板中接種細胞懸液（100 μL/孔）。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)一段時間（37℃,5% CO2）。

2、向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù)）。

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時。

4、用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

5、若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化。

三. 細胞增殖-毒性檢測

1、在96孔板中配制100 μL的細胞懸液。將培養(yǎng)板放在培養(yǎng)箱預培養(yǎng)24小時（37℃，5% CO2）。

2、向培養(yǎng)板加入10 μL不同濃度的待測物質(zhì)。

3、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育一段適當?shù)臅r間（例如：6、12、24或48小時）。

4、向每孔加入10 μL CCK-8溶液（注意不要再孔中生成氣泡，它們會影響OD值的讀數(shù)）。

5、將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時。

6、用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。

7、若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10 μL 0.1M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化。

注意：如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。

       活力計算

     細胞活力*（％）=[A(加藥)-A（空白）]/[A（0加藥）-A（空白）] ×100
     A（加藥）：具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度
     A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光度
     A（0加藥）：具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度
     *細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力

注意事項：

1） 建議先做幾個孔摸索接種細胞的數(shù)量和加入CCK-8試劑后的培養(yǎng)時間。

2） 有條件的情況下建議采用多通道移液器，可以減少平行孔間的差異。加入CCK-8試劑時，建議斜貼著培養(yǎng)板壁加，不要插到培養(yǎng)基液面下加，容易產(chǎn)生氣泡，會干擾OD值讀數(shù)。

3） 白細胞可能需要培養(yǎng)較長時間。

4） 當使用標準96孔板時，貼壁細胞的最小接種量至少為1,000 個/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。檢測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500 個/孔 (100 μL 培養(yǎng)基)。如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養(yǎng)基總體積的10%加入CCK-8溶液。

5） 如果沒有450 nm的濾光片，可以使用吸光度在430-490 nm之間的濾光片，但是450 nm濾光片的檢測靈敏度最高。

6） 培養(yǎng)基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。

本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應用或其他用途。