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產(chǎn)品說(shuō)明：

使用說(shuō)明：

產(chǎn)品描述：

Fluo-8，是目前最亮的可見(jiàn)光激發(fā)波長(zhǎng)Ca2+熒光探針,其熒光強(qiáng)度比Fluo-4強(qiáng)兩倍，比Fluo-3強(qiáng)四倍。Fluo-8具中等程度的Ca2+親和力，幾乎接近Fluo-3，F(xiàn)luo-4 (Fluo-3: Kd=0.4μM. Fluo-4: Kd=0.36μM、Fluo-4: Kd= 0.389μM)，使用上幾乎同F(xiàn)luo-3和Fluo-4。

Fluo-8不僅維持Fluo-3，F(xiàn)luo-4便捷的光譜檢測(cè)特性，與Ca2+結(jié)合后的最大激發(fā)波長(zhǎng)為490nm, 最大發(fā)射波長(zhǎng)為514nm。而且具有改善的細(xì)胞載入和Ca2+響應(yīng)能力。Fluo-8加載具較弱的溫度依賴性，在室溫或37°C孵育皆染色良好，不像Fluo-3, Fluo-4嚴(yán)格要求在37℃孵育， 此特征使其更適用于HTS高通量篩選實(shí)驗(yàn)。Fluo-8應(yīng)用廣泛，與許多細(xì)胞系和靶向樣本兼容，不會(huì)受配體或靶標(biāo)本身信號(hào)干擾。Fluo-8可通過(guò)激光共聚焦顯微鏡流式細(xì)胞儀、熒光酶標(biāo)儀。熒光顯微鏡等來(lái)檢測(cè)胞內(nèi)鈣離子水平的變化。

Fluo-8, AM是Fluo-8的一種乙酰甲酯衍生物，具有細(xì)胞膜滲透性，只需簡(jiǎn)單培養(yǎng)，即可輕易進(jìn)入細(xì)胞。一旦進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，即被其內(nèi)酯酶剪切生成不具膜滲透性的Fluo-8,從而滯留在細(xì)胞內(nèi)以發(fā)揮相應(yīng)生理功能。本品以50μg小包裝的凍干粉形式供貨，用于細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平檢測(cè)時(shí)，常用濃度為1-5μM。

操作說(shuō)明：

一.使用鈣指示劑AM Esters加載細(xì)胞：

     AM酯是非極性酯，其易于穿過(guò)活細(xì)胞膜，并且通過(guò)活細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞酯酶快速水解。 AM酯廣泛用于非侵入性地將各種極性熒光探針裝載到活細(xì)胞中。 但是，使用AM酯時(shí)必須小心，因?yàn)樗鼈円子谒?，特別是在溶液中。 它們應(yīng)在使用前用高質(zhì)量的無(wú)水二甲基亞砜（DMSO）重新配制。 DMSO儲(chǔ)備溶液應(yīng)在-20°C下干燥儲(chǔ)存并避光。 在這些條件下，AM酯應(yīng)穩(wěn)定數(shù)月。

     以下是我們推薦的將AM酯加載到活細(xì)胞中的方案。該方案僅提供指南，實(shí)際情況應(yīng)根據(jù)您的具體需求進(jìn)行修改。

a）在高質(zhì)量無(wú)水DMSO中制備2至5 mM AM酯原液。

b）在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，將鈣指示劑溶解在DMSO中或?qū)⒌确莸闹甘緞﹥?chǔ)備溶液解凍至室溫。使用0.02％Pluronic?F-127在您選擇的緩沖液（如Hanks和Hepes緩沖液）中制備1至10μM的工作溶液。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞系，我們建議鈣指示劑的最終濃度為4-5 uM。 細(xì)胞加載所需指標(biāo)的確切濃度必須根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定。 為避免因過(guò)載和潛在染料毒性引起的任何偽影，建議使用可產(chǎn)生足夠信號(hào)強(qiáng)度的最小探針濃度。

注意：非離子洗滌劑Pluronic?F-127有時(shí)用于增加鈣指示劑AM酯的水溶性。

c）如果您的細(xì)胞含有有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，可以在細(xì)胞培養(yǎng)基中加入丙磺舒（1-2.5 mM）或磺吡酮（0.1-0.25 mM），以減少脫酯化指標(biāo)的泄漏。 在室溫或37°C下用鈣指示劑酯孵育細(xì)胞20分鐘至1小時(shí)。

d）在HHBS或您選擇的緩沖液（含有陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白抑制劑，如2.5mM丙磺舒，如果適用）中洗滌細(xì)胞1-2次以除去過(guò)量的探針。

e）在所需的Ex / Em波長(zhǎng)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

二.測(cè)量細(xì)胞內(nèi)鈣響應(yīng)：

     為了確定溶液的游離鈣濃度或單波長(zhǎng)鈣指示劑的Kd，使用以下等式：[Ca]free = Kd[F - Fmin]/Fmax - F]

     其中F是實(shí)驗(yàn)鈣水平下指示劑的熒光，F(xiàn)min是不存在鈣時(shí)的熒光，F(xiàn)max是鈣飽和探針的熒光。 解離常數(shù)（Kd）是探針對(duì)鈣的親和力的量度。 與校準(zhǔn)溶液相比，熒光指示劑的Ca2 +結(jié)合和光譜性質(zhì)在細(xì)胞環(huán)境中變化非常顯著。 細(xì)胞內(nèi)指標(biāo)的原位校準(zhǔn)通常產(chǎn)生顯著高于體外測(cè)定的Kd值。 通過(guò)在離子載體如A-23187,4-溴A-23187和離子霉素存在下將加載的細(xì)胞暴露于受控的Ca 2+緩沖液來(lái)進(jìn)行原位校準(zhǔn)。 或者，細(xì)胞透化劑如洋地黃皂苷或X-100可用于將指示劑暴露于細(xì)胞外培養(yǎng)基的受控Ca2 +水平。

注意事項(xiàng)：

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并帶一次性手套操作。

本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應(yīng)用或其他用途。