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產(chǎn)品說(shuō)明：

使用說(shuō)明：

產(chǎn)品描述：

細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中常使用Fluo-3, AM作為一種熒光探針來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化。其檢測(cè)原理基于Fluo-3,AM可穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞，之后被細(xì)胞內(nèi)的酯酶剪切形成Fluo-3，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)。Fluo-3游離配體幾乎是非熒光性的，其熒光不會(huì)隨鈣離子濃度升高而增強(qiáng)。但是，當(dāng)它與細(xì)胞內(nèi)鈣離子結(jié)合后可以產(chǎn)生較強(qiáng)的熒光，熒光會(huì)增加60至80倍。

Fluo-4, AM是鈣指示劑Fluo-3,AM的升級(jí)版本，主要變化為后者分子上的兩個(gè)氯原子被Fluo-4,AM上的氟所取代，該結(jié)構(gòu)上的微小變化使Fluo-4,AM加載更快，在相同濃度下檢測(cè)信號(hào)更強(qiáng)。

本產(chǎn)品為Fluo-4,AM粉末狀，用于細(xì)胞內(nèi)鈣離子檢測(cè)時(shí)，F(xiàn)luo-4, AM的常用濃度為0.5-5 μM。

操作說(shuō)明：

一. 需要試劑準(zhǔn)備：

1. （可選）配制Pluronic F-127母液：100mg Pluronic F-127粉末（Cat No. 60318ES60）中加入0.5 mL DMSO，配制成20%(w/v)的DMSO母液。溶解過(guò)程需要在40-50℃加熱20-30 min。溶液室溫保存，不要冷藏。如果有結(jié)晶析出，可以重新加熱后溶解，不影響使用。

2. Hanks?balanced salt solution

二、操作步驟： 

1）Fluo-4,AM母液的配制：向 Fluo-4, AM中加入適量DMSO，配制成1-5 mM的儲(chǔ)存液，DMSO的加入量根據(jù)Fluo-4,AM（MW1096.94）分子量進(jìn)行計(jì)算（如：若配制成1mM的母液，需向50 ug Fluo-4,AM中加入45.6 uL DMSO）。

【注】：溶解用的DMSO需要保證新鮮無(wú)水，否則將會(huì)導(dǎo)致 AM 體水解，使熒光染料無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞，影響實(shí)驗(yàn)效果。

2）Fluo-4,AM工作液的配制：利用HBSS將Fluo-4,AM稀釋成1-5μM的工作液，具體稀釋方法如1 mM母液配制1 mL濃度為4 μM工作液，用1 mL HBSS溶液稀釋4 μL 1 mM母液即可。

【注】：①推薦該探針加載濃度在4-5 μM，具體的使用濃度需根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化。為了避免過(guò)度加載造成細(xì)胞毒性，建議在取得有效結(jié)果的基礎(chǔ)上盡量使用最低探針濃度。

② Fluo-4,AM工作液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避免反復(fù)凍存。

3）（可選）如果Fluo-4進(jìn)入細(xì)胞的效果不好，可向 Fluo-4, AM/DMSO 溶液中加入適量20% Pluronic F127溶液，最終稀釋至其終濃度為0.04-0.05%，Pluronic F127 可以防止 Fluo-4, AM 在 HBSS中聚合并能幫助其進(jìn)入細(xì)胞。

【注】：Pluronic F127可降低Fluo-4,AM的穩(wěn)定性，因此只建議在配制工作液時(shí)加入，不建議將其加入儲(chǔ)存液長(zhǎng)期保存。

4）取出預(yù)培養(yǎng)的細(xì)胞，除去培養(yǎng)基，使用 HBSS 溶液洗滌細(xì)胞 3次。

【注】：如果使用含血清的培養(yǎng)基，血清中的酯酶會(huì)分解 AM 體，從而降低 Fluo 4-AM 進(jìn)入細(xì)胞的效果。另外含有酚紅的培養(yǎng)基會(huì)使本底值略微偏高，所以加工作液之前需盡量去除培養(yǎng)基殘留。

5）將 Fluo-4, AM工作液加入細(xì)胞，加入量以覆蓋細(xì)胞為準(zhǔn)。在37℃培養(yǎng)10-60 min，然后除去 Fluo 4-AM 工作液。

【注】：關(guān)于孵育的時(shí)間，如果首次做實(shí)驗(yàn)不能確定，建議先孵育30分鐘，看熒光效果：如果細(xì)胞死亡較多，適當(dāng)縮短時(shí)間；如果熒光強(qiáng)度太弱，適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間。

6）用HBSS溶液洗滌細(xì)胞 3 次，以充分去除殘留的 Fluo 4-AM 工作液。然后加入 HBSS 溶液覆蓋細(xì)胞。

7）37℃培養(yǎng)箱孵育約 20-30 分鐘，以確保 AM 體在細(xì)胞內(nèi)的完全去酯化作用。

8）用激光共聚焦或熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞，激發(fā)波長(zhǎng) 494 nm，發(fā)射波長(zhǎng) 516 nm。

注意事項(xiàng)：

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并帶一次性手套操作。

本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應(yīng)用或其他用途。