訂購信息：
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目錄號 |
產品名稱 |
規(guī)格 |
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X13134 |
PEI 40K Transfection Reagent 線性化聚乙烯亞胺轉染試劑 |
1ml |
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X13135 |
PEI 40K Transfection Reagent 線性化聚乙烯亞胺轉染試劑 |
10ml |
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X13136 |
PEI 40K Transfection Reagent 線性化聚乙烯亞胺轉染試劑 |
50ml |
特性說明：
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濃度 |
1mg/ml |
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運輸條件 |
室溫運輸 |
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儲存條件 |
常溫保存，4℃可延長保存，有效期1年 |
產品描述：
線性化聚乙烯亞胺PEI 40000 (Polyethylenimine Linear, MW 40000; PEI 40K)是一款優(yōu)秀和低成本的瞬時性轉染試劑。 在HEK293和CHO表達系統(tǒng)中，PEI在寬廣的生產規(guī)模內(從96孔板到100L生物反應器) 能提供連續(xù)性的高基因表達。
作為線性化聚Z烯亞胺PEI25000 (PEI 25K)的升級產品，操作更簡單，且具有連續(xù)性的更高表達滴度，優(yōu)勢在于: 1) PEI 25K轉染溶液通常需幾個小時來配置，然而，PEI 40K在2個小時內即可轉化為即用型的溶液; 2) PEI 25K含4-11%殘留的丙?；鶊F，該基團阻止聚合物骨架緊密結合到DNA。然而，PEI 40K完全去丙?；Y構，意味著每個批次保持連續(xù)性更高轉化效率。
本品是PEI 40K的無菌溶液，濃度為1mg/ml,直接使用即可。1ml本品足以用來轉染250μg DNA,或者，6孔板內約做60- 120次轉染。
試劑準備:
稀釋液準備:用細胞培養(yǎng)級水來制備150mM NaCl (比如: 稱取876.6mg高純NaCI加入80ml細胞培養(yǎng)級水，充分溶解后，定容到100ml,經(jīng)0.1或0.2μm濾膜過濾除菌。)
[注意] :也可使用商業(yè)化的無血清培養(yǎng)基(比如Opti-MEM |)來制備轉染復合物。
一、貼壁細胞操作方法
1.1鋪板
a) 轉染前18-24h進行鋪板，調整合適的細胞密度(參考表1)，使其在轉染時細胞密度達60-80%.[注意] :高血清水平會抑制轉染效率，大多數(shù)情況，低血清水平(≤5%) 能產生最高的轉染效率。
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表1.不同培養(yǎng)皿的建議接種密度 |
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培養(yǎng)器皿 |
培養(yǎng)表面積 |
接種細胞數(shù) |
培養(yǎng)器皿 |
培養(yǎng)表面積 |
接種細胞數(shù) |
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96孔板 |
0.3（cm2） |
（1.2-2.4）X 104 |
35mm培養(yǎng)皿 |
9.6（cm2） |
（3.5-7.0）X 105 |
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48孔板 |
1.0（cm2） |
（4.0-8.0）X 104 |
60mm培養(yǎng)皿 |
21（cm2） |
（0.9-1.8）X 106 |
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24孔板 |
1.9（cm2） |
（0.8-1.6）X 105 |
100mm培養(yǎng)皿 |
58（cm2） |
（2.2-4.4）X 106 |
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12孔板 |
3.5（cm2） |
（1.5-3.0）X 105 |
T75培養(yǎng)瓶 |
75（cm2） |
（3.0-6.0）X 106 |
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6孔板 |
9.6（cm2） |
（4.0-8.0）X 105 |
T175培養(yǎng)瓶 |
175（cm2） |
（0.7-1.4）X 107 |
1.2轉染步驟(以6孔板的單孔為例)
a)轉染前1-2h, 每孔替換為3m|含2%血清的新鮮生長培養(yǎng)基。
b)制備PEI 40K-DNA轉染復合物(嚴格按照順序進行) :①往300μI稀釋液內加入2μg質粒DNA,低速混合/渦旋均勻;②往混合物內加入8μIPEI 40K (1mg/ml) (DNA/PEI 40K=1: 4)， 低速渦旋5s;③無菌環(huán)境，室溫靜置20min以形成PEI 40K-DNA轉染復合物。④用移液槍上下吹打3次，輕輕混勻。
c)將PEI 40K-DNA轉染復合物轉到孔內。輕輕晃動培養(yǎng)皿或輕微渦旋，使得復合物分散均勻。
[注意] :以上步驟可通過調整PEI 40K-DNA復合物在稀釋液內的體積(稀釋液為培養(yǎng)總體積的10%)來進行放大或縮小(可參考表2)。確保DNA/PEI 40K=1: 4!
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表2.不同培養(yǎng)體系內轉染用各組分建議用量 |
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培養(yǎng)器皿 |
培養(yǎng)體積(ml) |
質粒DNA（ug） |
稀釋液 |
PEI 40K（ul） |
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6孔板，單孔 |
3 |
2-4 |
0.3 |
8-16 |
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35mm培養(yǎng)皿 |
3 |
2-4 |
0.3 |
8-16 |
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60mm培養(yǎng)皿 |
5 |
6-12 |
0.5 |
24-48 |
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100mm培養(yǎng)皿 |
10 |
12-24 |
1.0 |
48-96 |
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T75培養(yǎng)瓶 |
15 |
18-36 |
1.5 |
72-144 |
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250ml搖瓶 |
50 |
50-100 |
2.5 |
200-400 |
1.3孵育
a) 37°C, 5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)細胞，轉染后12-18h,去除含PEI 40K-DNA復臺物的培養(yǎng)液，更換新鮮的生長培養(yǎng)基。
b) 通常，轉染后36-48h能檢測到重組蛋白表達。一般在轉染后72-96h能觀察到最大水平的表達。
二、懸浮細胞操作方法
2.1接種準備
于轉染前2-3h,按照1 .0x 106/ml培養(yǎng)接種細胞。
2.2轉染步驟(以: 50ml培養(yǎng)物/250ml搖瓶為例)
a)制備PEI 40K-DNA轉染復合物(嚴格按照順序進行) :①往2.5ml稀釋液內加入50μg質粒DNA,低速混合/渦旋均勻;②往混合物內加入200μl PEI 40K (1mg/ml) (DNA/PEI 40K=1: 4)，低速渦旋5s;③無菌環(huán)境，室溫靜置20min以形成PEI 40K-DNA轉染復合物。④用移液槍上下吹打3次，輕輕混勻。
b)將全部轉染溶液加入25ml懸浮細胞內。
c)將懸浮細胞放回培養(yǎng)箱內。
2.3孵育
a)在培養(yǎng)箱內搖動培養(yǎng)2-3h,之后加入25ml新鮮生長培養(yǎng)基。重新放回培養(yǎng)箱。
b)通常,轉染后36-48h能檢測到重組蛋白表達。一般在轉染后72-96h能觀察到最大水平的表達。
注意事項：
1) 請務必使用高質量的無內毒素質粒。通過260 nm光吸收測定DNA濃度, 260nm/280nm比值確定DNA純度(比值應該在1.8 ~ 2.0的范圍之內)。如有可能，請通過瓊脂糖凝膠電泳檢測質粒的完整性。
2)使用適當保存和經(jīng)常傳代的健康細胞。確保培養(yǎng)基沒有被細菌、真菌或支原體污染。如果細胞是近期復蘇的液氮凍存細胞，請在轉染前至少傳代兩次。
3)對于某些類型的細胞如HEK-293、HEK293T、NIH/3T3和COS細胞， 在轉染前兩天鋪板可顯著提高重組蛋白的表達水平。如果選擇轉染前兩天鋪板，可適當降低鋪板密度，以確保轉染時細胞的匯合度仍為60-80%。
4)對于接觸抑制敏感的細胞，可適當降低鋪板密度。
5)為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
本產品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應用或其他用途。
