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產(chǎn)品說(shuō)明：

作用機(jī)制:

X-Gluc，也稱為5- Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-D-glucuronide (5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡糖苷酸)， 是β-葡萄糖苷酶 (β-glucuronidase, GUS)的顯色底物，由一種廣泛使用的報(bào)告基因gusA (uidA) 所編碼。GUS水解X-Gluc, 生成一種無(wú)色的葡萄糖醛酸和一種肉眼可見(jiàn)的氯-溴靛藍(lán)(chloro-bromoindigo) 深藍(lán)色沉淀。利用這一特性, X-Gluc常 用來(lái)檢測(cè)植物細(xì)胞和組織中的GUS表達(dá);另外, X-Gluc還能用來(lái)檢測(cè)大腸桿菌引起的感染狀況;或檢測(cè)食物或水源是否受細(xì)菌污染。

主要應(yīng)用：轉(zhuǎn)基因植物報(bào)告基因GUS活性檢測(cè)，X-gluc用作顯色底物。

普遍應(yīng)用優(yōu)勢(shì)在于：絕大多數(shù)植物細(xì)胞內(nèi)不存在內(nèi)源性的GUS活性,而且GUS基因表達(dá)產(chǎn)物具有檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、靈敏度高，易于定量及定性分析，能夠與其他蛋白質(zhì)基因融合等優(yōu)勢(shì)，因此，GUS基因?yàn)橹参锕こ萄芯恐袘?yīng)用最廣泛的報(bào)告基因(報(bào)道基因)之一。

1. GUS活性檢測(cè)(組織化學(xué)定位法,定性研究)

GUS催化底物X-gluc在酶活性位點(diǎn)生成深藍(lán)色沉淀，為研究外源基因在植物中表達(dá)具體部位研究提供很好的研究手段。且GUS酶和顯色產(chǎn)物非常穩(wěn)定，植物中可以積累。

1.1 GUS染色液制備[作為參考，可按照具體實(shí)驗(yàn)條件來(lái)調(diào)整]

1.2 GUS定性染色步驟

a)于預(yù)冷固定液(4%多聚甲醛溶液，新鮮制備)固定樣本30min,偶爾搖晃或置于低速搖床上固定;

b)使用預(yù)冷的1 x磷酸鹽或檸檬酸鹽酸溶液清洗固定樣本30-60min,中間更換幾次清洗液;

c)真空滲透法將X-Gluc染色液加入待染色樣本 [對(duì)于組織培養(yǎng)的擬南芥不需用真空滲透; ]黑暗條件室溫或者37°C孵育幾小時(shí)或過(guò)夜,或者明顯的藍(lán)色沉淀出現(xiàn)(不超過(guò)24h) ;

d)去離子清洗染色樣本;

e)對(duì)于綠色樣本， 使用70%乙醇脫色直到葉綠體完全去除，然后轉(zhuǎn)移到去離子水內(nèi)清洗;對(duì)于種子或其他樣本，參考文獻(xiàn)An ImprovedClearing Method for GUS Assay inArabidopsis Endosperm and Seeds的替代方法;

f) 肉眼或顯微鏡下觀察，白色背景上的藍(lán)色小點(diǎn)即為GUS表達(dá)位點(diǎn)。

[備注] :可直接訂購(gòu)我司(MKbio) 提供的GUS染色試劑盒(組織化學(xué)法) , 經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，使用方便,節(jié)省溶液配制的大量麻煩步驟。

2. GUS活性檢測(cè)(熒光分析法,定量研究)

GUS催化熒光底物MUG 4-甲基傘型酮-beta-D-葡糖苷酸,將其水解為4-MU (4-甲基傘型酮)和β-D-葡萄糖醛酸。4-MU中的羥基解離后在365nm的光激發(fā)下產(chǎn)生455nm的熒光。此時(shí)用熒光分光光度計(jì)測(cè)定得到的是相對(duì)值,因此同時(shí)需要用標(biāo)準(zhǔn)物4-MU進(jìn)行校準(zhǔn)。

熒光定量分析GUS活性有兩種基本方法: 1) 在一個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定GUS酶作用產(chǎn)物的總熒光量， 需要設(shè)定空白對(duì)照，以消除內(nèi)源熒光強(qiáng)度; 2)測(cè)定一段時(shí)間內(nèi)GUS的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。在酶反應(yīng)初始階段，酶作用產(chǎn)物與時(shí)間呈線性關(guān)系，而內(nèi)源性熒光物質(zhì)的熒光量與時(shí)間無(wú)線性關(guān)系。由此可計(jì)算GUS酶活力。GUS酶活性通常以μg MU/min/mg蛋白質(zhì)。有時(shí)也可以用樣本的鮮重來(lái)表示。

2.1檢測(cè)步驟[僅作參考，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)條件做適當(dāng)調(diào)整]

a)取約100mg愈傷組織或一片新鮮葉盤(pán)于1.5m|離心管內(nèi),加入100u|萃取緩沖液(extraction buffer)內(nèi)勻漿?？杉尤肷倭可匙踊虿Ａе樘岣哐心バ省?

萃取緩沖液(extraction buffer) 配方: 50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)，10mM DTT, 1mM Na2EDTA, 0.1%十二烷基肌氨酸，0.1%Triton X-100

b) 4°C, 15.000rpm離心5min.收集上清轉(zhuǎn)移到另一干凈的1.5ml離心管， 冰上放置待用。

c)取50μl 上述萃取上清到0.5ml 37°C預(yù)熱的反應(yīng)緩沖液(Assay buffer) ;用移液槍吹勻或漩渦混勻。

反應(yīng)緩沖液(Assay Buffer) :稱取17.6mg MUG溶于50ml萃取緩沖液,此時(shí)即為1mM MUG反應(yīng)液。4°C保存，2周穩(wěn)定。

d)在某一時(shí)間段內(nèi)(高GUS活性樣本30min;或低GUS活性1h-過(guò)夜; )吸取100μl溶液到含900μl終止液(Stop Buffer)的1.5ml離心管內(nèi)，做好標(biāo)記。有可能采集3-4個(gè)時(shí)間點(diǎn)和過(guò)夜孵育的時(shí)間點(diǎn)熒光量。[用熒光分光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)365nm、 發(fā)射波長(zhǎng)455nm下，狹縫10nm時(shí)測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度值。]

e)以熒光強(qiáng)度值對(duì)反應(yīng)時(shí)間作曲線，求出單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化。用單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化除以參加反應(yīng)的蛋白量,求出單位質(zhì)量的蛋白單位時(shí)間的熒光強(qiáng)度變化。

注意事項(xiàng)：

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應(yīng)用或其他用途。