什么是二抗？

二抗是在其它宿主體內(nèi)制備的能與一抗或一抗片段結(jié)合的抗體，上面通常連有酶或熒光素等標(biāo)簽。由于二抗所具備的優(yōu)點(diǎn)使得其在免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中得以應(yīng)用廣泛，如western blot（通過(guò)與特異性抗體結(jié)合來(lái)鑒定蛋白質(zhì)），ELISA（以耦聯(lián)有酶的抗體或抗原為標(biāo)記來(lái)檢測(cè)特異性的蛋白質(zhì)，尤其是相應(yīng)的抗原或抗體），免疫組織化學(xué)（檢測(cè)組織中的特異性抗原），免疫細(xì)胞化學(xué)（通過(guò)免疫學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞的抗原組成），流式細(xì)胞術(shù)（通過(guò)檢測(cè)激光所激發(fā)熒光來(lái)鑒定分離不同類(lèi)型的細(xì)胞）及免疫沉淀（通過(guò)抗原與抗體的特異性結(jié)合作用來(lái)分離相應(yīng)抗原）。

使用二抗的優(yōu)勢(shì)？

二抗針對(duì)某一特定物種（如小鼠）的所有抗體均具有特異性，因而使用標(biāo)記的二抗可以免去對(duì)每一個(gè)一抗進(jìn)行標(biāo)記，大大節(jié)省了時(shí)間和費(fèi)用；此外，一個(gè)一抗分子可以同時(shí)結(jié)合幾個(gè)二抗分子，從而使信號(hào)大大增強(qiáng)，提高了實(shí)驗(yàn)靈敏度。二抗可以耦聯(lián)有幾種不同的標(biāo)記，可以是酶，熒光素，或生物素。

如何選擇二抗？

檢測(cè)任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，同時(shí)在后繼試驗(yàn)中也會(huì)有不同的檢測(cè)方案，因此在選擇二抗的時(shí)候要綜合考慮一抗的類(lèi)型及后繼檢測(cè)方案的要求，其中如何根據(jù)一抗的種屬來(lái)源和類(lèi)型選擇二抗尤為重要。小編根據(jù)以往的經(jīng)驗(yàn)整理了一下選擇的要點(diǎn)：

1. 一抗的種屬來(lái)源

二抗應(yīng)選用與使用的一抗相同的物種來(lái)源，例如：如果你的一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是從兔血清里制備的兔源多克隆抗體，則相應(yīng)的二抗需要選擇抗兔的二抗。即根據(jù)一抗的物種來(lái)源選擇相應(yīng)的抗該物種的二抗。

2. 一抗是屬于哪個(gè)類(lèi)或亞類(lèi)

除了要與一抗的種屬來(lái)源相一致，二抗還需與一抗的類(lèi)別或亞類(lèi)相匹配，這通常是針對(duì)單克隆抗體而言。一般來(lái)說(shuō)多克隆抗體主要是IgG類(lèi)免疫球蛋白，因此相應(yīng)的二抗就是抗IgG抗體。而單克隆抗體則相對(duì)復(fù)雜些，由于單克隆抗體有不同的類(lèi)別和亞型，因此相應(yīng)的二抗也需要根據(jù)這些亞型進(jìn)行選擇。

單克隆抗體的類(lèi)別及亞類(lèi)通常會(huì)在產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中都會(huì)有描述，如果您的一抗是小鼠IgM，那么相應(yīng)的二抗就應(yīng)當(dāng)是抗小鼠IgG抗體。如果單克隆一抗是小鼠 IgG的某一亞類(lèi)（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結(jié)合，或者您也可以選擇專(zhuān)門(mén)針對(duì)這一亞類(lèi)的二抗，例如，如果您的一抗是小鼠IgG1，那么您可以選擇抗IgG1的二抗，此種抗體在雙標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中尤其適合。在不清楚一抗為何種類(lèi)/亞類(lèi)的情況下，可以選用抗相應(yīng)物種IgG，因?yàn)榇朔N抗體可以識(shí)別大多數(shù)類(lèi)型的IgG免疫球蛋白。

3. 二抗的種屬來(lái)源

一般來(lái)說(shuō)，不同的種屬來(lái)源與二抗的質(zhì)量沒(méi)有必然的聯(lián)系，來(lái)源于山羊的二抗與來(lái)源于驢的二抗在一般的實(shí)驗(yàn)里沒(méi)有太多的差別。然而在一些特殊的實(shí)驗(yàn)里，如雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)里，如果其中一個(gè)一抗是山羊來(lái)源的，一個(gè)是小鼠來(lái)源的，則相應(yīng)的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗，這時(shí)候，二抗就不能選擇山羊或者小鼠來(lái)源的。選擇相應(yīng)的驢來(lái)源的二抗，就非常適合做類(lèi)似雙標(biāo)的免疫實(shí)驗(yàn)。雙標(biāo)得2個(gè)都抗才行，故選擇第3個(gè)種源的抗體

4. 選擇哪種形式的二抗，是整個(gè)IgG分子，F(ab')2片段，還是Fab片段？

整個(gè)IgG分子：此種抗體適用于多數(shù)情況。

F(ab')2片段：該種抗體是由兩個(gè)靠二硫鍵連接的用于結(jié)合抗原的Fab片段組成， 這些抗體用在特定的情況中，如需要避免抗體與具有Fc受體的細(xì)胞結(jié)合的情況。

Fab片段：它們只有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，一般用來(lái)封閉內(nèi)源性免疫球蛋白。

5. 二抗的耦聯(lián)標(biāo)記

 一般來(lái)講，耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶，熒光基團(tuán)（FITC, RRX, TR, PE）和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實(shí)驗(yàn)。對(duì)于western blot和ELISA，最常用的二抗是酶標(biāo)二抗，而細(xì)胞或組織標(biāo)記實(shí)驗(yàn)（細(xì)胞免疫化學(xué)，組織免疫化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù)）中通常使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過(guò)氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測(cè)信號(hào)，可以使用biotin/avidin檢測(cè)系統(tǒng)。在一些熒光檢測(cè)方案中，則需要選擇不同的熒光標(biāo)記；而金顆粒標(biāo)記的二抗則更多的應(yīng)用于免疫電鏡中。

6. 抗體的純度

親和層析純化的抗體一般更受人們歡迎，因?yàn)檫@些產(chǎn)品的純度最高，產(chǎn)生的非特異性背景最少。但是有些情況下也要考慮到純化過(guò)程中損失的IgG部分，因?yàn)槠渲泻杏H和力很高的抗體，尤其是當(dāng)目的抗原存在的量很小的時(shí)候，高親和性的IgG部分就顯得尤為重要。

下面總結(jié)了幾種具有不同特異性的二抗

1）針對(duì)整個(gè)抗體分子（H＋L）具有特異性：

如anti-IgG(H+L)，此類(lèi)抗體既可以與抗體的重鏈結(jié)合也可以與輕鏈結(jié)合，即與抗體分子的Fc，F(ab')2/Fab部分均可反應(yīng)，anti- IgG(H+L)也可以與其他免疫球蛋白家族反應(yīng)（如IgM和IgA），因?yàn)樗械拿庖咔虻鞍锥季哂邢嗤妮p鏈（κ鏈或λ鏈）。

2）針對(duì)Fab片段具有特異性：

這類(lèi)抗體與重鏈輕鏈均可以結(jié)合，由于它們可以與輕鏈反應(yīng)，它們同時(shí)也可以和具有相同輕鏈的其他種類(lèi)的免疫球蛋白反應(yīng)。

3）針對(duì)Fc片段或重鏈具有特異性：

這類(lèi)抗體和重鏈的Fc部分反應(yīng)，因此它們是類(lèi)別特異性的。即gamma鏈特異性抗體只與IgG反應(yīng)，mu鏈特異性抗體只識(shí)別IgM，依此類(lèi)推。

4）輕鏈（lambda，kappa）特異性：

與所有類(lèi)別的抗體反應(yīng)，因?yàn)樗蓄?lèi)別的抗體均具有相同的lambda鏈或kappa鏈。

5）經(jīng)過(guò)吸附處理的二抗：

不同來(lái)源的免疫球蛋白含有相似的結(jié)構(gòu)，抗一個(gè)物種的抗體可能與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng)，因此有些二抗經(jīng)過(guò)了動(dòng)物或人類(lèi)IgG吸附處理，以減少非特異性背景。 例如，如果是小鼠的組織或細(xì)胞，那么選擇經(jīng)小鼠血清或IgG吸附處理過(guò)的二抗可以減少非特異性結(jié)合。但是此種抗體識(shí)別表位的數(shù)量被大大減少。